1.本发明涉及植物修复技术领域，尤其涉及一种利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法。
背景技术：
2.近年来，镉(cd)污染问题倍受人们关注。植物修复技术以环保、低廉、高效等特点，具有广泛应用前景。
3.向日葵生育周期短、生物量大、富集重金属能力较强，被广泛应用于镉污染土壤修复中。研究表明，添加丛枝菌根可以提高向日葵对重金属的累积(andrade s,silvei ra,a,jorge r,abreu m.cadmium accumulation in sunflower plants influenced by arbuscular mycorrhiza.international journal of phytoremediation,2008,(10):1-14.awotoye o,adewole m,salami a,ohiembor m.arbuscular mycorrhiza contribution to the growth performance and hea vy metal uptake of helianthus annuus linn in pot culture.2009,3(7):157-163.ker k,charest c.nickel remediation by am-colonized sunflower.mycorrhiza,2010,20(6):399-406.)；moradk hani等(moradkhani,s.,nejad,r.a.k.,dilmaghani,k.,chaparzadeh,n.,2013.salicylic acid decreases cd toxicity in sunflower plants.annals of biological research,4(1):135-141.)研究表明水杨酸可以降低cd对向日葵的毒害；等( e,evangelou m w h,rob insonb b h,et al.effects of indole-3-acetic acid(iaa)on sunflower growth and heavy metal u ptake in combination with ethylene diamine disuccinic acid(edds).chemosphere,2010,901-907)研究表明3-吲哚乙酸(iaa)可以缓解向日葵对pb和zn的毒害，且螯合剂edds与iaa复配显著提高植物吸收cd的能力。陈立等(陈立,王丹,龙婵,等.3种螯合剂对向日葵修复镉污染土壤的影响.环境科学与技术,2017,40(11):22-29.)研究了ca、草酸和e dds三种螯合剂的添加有效提高向日葵对cd的吸收、转运能力。
4.然而，目前还没有5-氨基乙酰丙酸(ala)与螯合剂复配提高向日葵修复土壤cd污染的报道。
技术实现要素：
5.本发明提供了一种利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，该方法可以在确保向日葵植株正常生长的情况下，更进一步地促进向日葵对污染土壤中重金属镉的吸收，提高向日葵对重金属镉污染土壤的修复效果。
6.具体技术方案如下：
7.本发明提供了一种利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，包括：
8.(1)向日葵种子播种后，幼苗栽至重金属镉污染的土壤上；
9.(2)在向日葵幼苗移栽3～4周后，向重金属镉污染土壤中施加螯合剂，并对向日葵幼苗的叶片喷施5-氨基乙酰丙酸试剂；
10.所述螯合剂为乙二胺-nn
’-
二琥珀酸三钠盐溶液或柠檬酸；
11.(3)对向日葵进行栽培管理，直至向日葵成熟，收获。
12.本发明采用0.3g
·
kg-1
高浓度cd处理模拟重度镉污染土壤，并通过添加螯合剂ca或edds以及喷施ala，来研究生长调节剂ala与螯合剂ca或edds之间的相互作用，发现生长调节剂ala与螯合剂ca或edds的联合应用提高了向日葵对土壤中cd的吸收，为植物修复cd污染土壤技术提供理论依据。
13.进一步地，所述重金属镉污染土壤中镉离子浓度为0.15g
·
kg-1
～0.30g
·
kg-1
。
14.进一步地，所述乙二胺-nn
’-
二琥珀酸三钠盐溶液的添加量为4～6mmol
·
kg-1
。
15.进一步地，所述柠檬酸的添加量为9～11mmol
·
kg-1
。
16.进一步地，所述5-氨基乙酰丙酸的添加量为9～11mg
·
l-1
。
17.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
18.本发明方法将生长调节剂5-氨基乙酰丙酸和重金属螯合剂乙二胺-nn
’-
二琥珀酸三钠盐溶液或柠檬酸进行联用，能够在确保向日葵植株正常生长的情况下，更进一步地促进向日葵对污染土壤中重金属镉的吸收，提高向日葵对重金属镉污染土壤的修复效果。
附图说明
19.图1为不同处理对向日葵植株抗氧化酶活性的影响；
20.其中；ck：对照；cd2；0.3g
·
kg-1cd处理；cd2+ca：0.3g
·
kg-1cd胁迫下添加ca；cd2+edds：0.3g
·
kg-1cd胁迫下添加edds；-ala,不喷施ala；+ala，叶面喷施ala；根据duncan’s测验，图中不同字母表示在p≤0.05水平上差异显著。
21.图2为不同处理对向日葵植株非蛋白巯基含量的影响；
22.其中；ck：对照；cd2；0.3g
·
kg-1
cd处理；cd2+ca：0.3g
·
kg-1
cd胁迫下添加ca；cd2+edds：0.3g
·
kg-1
cd胁迫下添加edds；-ala,不喷施ala；+ala，叶面喷施ala；根据duncan’s测验，图中不同字母表示在p≤0.05水平上差异显著。
23.图3为不同处理对向日葵植株谷胱甘肽含量的影响；
24.其中；ck：对照；cd2；0.3g
·
kg-1
cd处理；cd2+ca：0.3g
·
kg-1
cd胁迫下添加ca；cd2+edds：0.3g
·
kg-1
cd胁迫下添加edds；-ala,不喷施ala；+ala，叶面喷施ala；根据duncan’s测验，图中不同字母表示在p≤0.05水平上差异显著。
25.图4为不同处理对向日葵植株根尖细胞超微结构的影响
26.其中，a,c,e,g分别表示ck，0.3g
·
kg-1
cd2，cd2+ca和cd2+edds没有ala处理组向日葵根尖细胞超微结构；b,d,f,h分别表示ala，cd2+ala,cd2+ca+ala和cd2+edds+ala叶面喷施ala的处理组向日葵根尖细胞超微结构；mc－线粒体，nm－核膜，nuc－核，nue－细胞核，cw－细胞壁，cm－细胞膜，p－质体小球(嗜锇颗粒)，s－淀粉粒；a,c,h－(
×
20000),b,e,f－(
×
25000),d,g－(
×
30000)。
具体实施方式
27.下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
28.实施例1
29.1、试验材料和试剂
30.向日葵(tk0409)的种子均由内蒙古农牧科学研究院植保所提供。以进口泥炭土营养土(hawita gruppe gmbh)为供试土壤。
31.5,5
’-
二硫代-2-硝基苯甲酸(dtnb，麦克林)、无水氯化镉、柠檬酸(ca，麦克林)，邻苯二甲醛(opa，索莱宝)，乙二胺-nn
’-
二琥珀酸三钠盐溶液(edds，sigma)均购于杭州科德诺生物技术有限公司。磷酸二氢钠(nah2po4)，磷酸氢二钾(k2hpo4)，聚乙二醇peg6000、碘化钾(麦克林)，还原辅酶ⅱ四钠盐(nadph)，l-氧化型谷胱甘肽(源叶)，谷胱甘肽还原酶(gr，来源于酿酒酵母，索莱宝)、还原型谷胱甘肽(gsh，索莱宝)，抗坏血酸(asa)等生理试剂均购于杭州科德诺生物技术有限公司。
32.2、试验方法
33.向日葵种子用70％酒精消毒后蒸馏水冲洗三遍，黑暗发芽两天后，将根等长的种子移栽到泥炭土、蛭石和珍珠岩体积比为4：2：1的基质中。将所有植物置于昼/夜温度恒为24/20℃，光照周期14/10h，湿度60％-70％，光强为200μmol m-2
s-1
的温室中进行培养，以cd含量为0g
·
kg-1
，0.15g
·
kg-1
和0.3g
·
kg-1
的cdcl2胁迫处理一周，植株仍正常生长，无萎蔫现象。
34.具体操作如下：
35.待植株长到6叶期(子叶全出土后三周左右)，cd含量为0g
·
kg-1
，0.3g
·
kg-1
的cdcl2以溶液的形式浇灌在向日葵幼苗周围土壤中，胁迫处理一周后，用针头注射器吸取配置好的edds(5mmol
·
kg-1
)/ca(10mmol
·
kg-1
)溶液，贴近土壤表层附近喷施，同时以10mg
·
l-1
ala叶面喷湿至近滴状态，因ala见光易分解，故选择遮光喷施，一周之后取样测定各项指标。
36.各处理设置如下：
37.ck：cdcl2胁迫处理(cd浓度为0g
·
kg-1
)，不做其他处理；
38.cd1：cdcl2胁迫处理(cd浓度为0.15g
·
kg-1
)，不做其他处理；
39.cd2：cdcl2胁迫处理(cd浓度为0.30g
·
kg-1
)，不做其他处理；
40.ca：10mmol
·
kg-1
ca处理，不做其他处理；
41.edds：5mmol
·
kg-1
edds处理，不做其他处理；
42.ala：向植株的叶面喷施10mg
·
l-1 5-氨基乙酰丙酸(ala)，不做其他处理；
43.cd2+ala：cd浓度为0.30g
·
kg-1
的cdcl2胁迫一周后，向植株的叶面单次喷施10mg
·
l-1 5-氨基乙酰丙酸(ala)；
44.cd2+ca：cd浓度为0.30g
·
kg-1
的cdcl2胁迫处理一次，一周后用10mmol
·
kg-1
ca处理植株一次；
45.cd2+edds：cd浓度为0.30g
·
kg-1
的cdcl2胁迫处理一次，一周后用5mmol
·
kg-1
edds处理植株一次；
46.cd2+ca+ala：cd浓度为0.30g
·
kg-1
的cdcl2胁迫处理一次，一周后用10mmol
·
kg-1
ca处理植株一次，同时单次向植株的叶面喷施10mg
·
l-1 5-氨基乙酰丙酸(ala)；
47.cd2+edds+ala：cd浓度为0.30g
·
kg-1
的cdcl2胁迫处理一次，一周后用5mmol
·
kg-1
edds处理植株，同时单次向植株的叶面喷施10mg
·
l-1 5-氨基乙酰丙酸(ala)。
48.测定向日葵植株根、茎和叶中的镉积累量以及生长指标和各生理生化指标以及超
微结构的变化。
49.(1)不同处理对向日葵植株根、茎和叶中的镉积累量的影响
50.取不同处理下向日葵根、茎和叶粉末0.05g，放入消解罐后加浓硝酸10ml，按照表1所示的程序在微波消解仪中进行消解，消解完全后将消解液倒入聚四氟乙烯烧杯中，在通风橱内加热至尽干，用超纯水定容于50ml离心管混匀，然后倒入5ml离心管，cd在向日葵根、茎和叶中的积累量用电感耦合等离子体质谱仪(icap rq)来测定cd含量；并按照以下计算方法计算富集系数(bcf)、转运系数(tf)、cd积累量(bcq)和提取效率(re)。富集系数(bioconcentration factor，bcf)＝植物地上部分(地下部分)cd含量(mg
·
kg-1)/土壤全cd含量(mg
·
kg-1)；
51.转运系数(translocation factor，tf)＝植物地上部cd含量(mg
·
kg-1)/植物根部cd含量(mg
·
kg-1)；
52.cd积累量(bioaccumulation quantity，bcq)＝植物各组织中cd含量(mg
·
kg-1)
×
植物各组织干重；
53.cd提取效率(remove efficiency，re)＝(植物cd积累量/土壤中cd总量)
×
100％。
54.表1微波消解工作程序
55.阶段罐数(个)爬坡时间(min)压力(psi)温度(℃)保温(min)1106400120221044001605310440020015
56.结果如表2和表3所示，与对照cd2(单独0.3g
·
kg-1
cd处理)相比，cd2+ala和cd2+edds、cd2+ca处理都显著增加了植株cd的积累量，且cd2+edds处理下，单株cd的积累量明显高于cd2+ca处理，说明螯合剂的使用可以有效提高植物对重金属cd的吸收，尤其是edds(表2)；其中，cd+edds+ala处理下cd的提取率最高(表2)。说明ala与edds/ca复配可以促进向日葵对cd的吸收。
57.表2不同处理对向日葵植株根、茎和叶中的镉积累量(bcq)和提取效率的影响
[0058][0059]
注：cd2为单独0.3g
·
kg-1
cd.表中数值为平均值
±
se.根据lsd测验，同一列中不同小写字母表示在p≤0.05水平上差异显著.
[0060]
表3不同处理对向日葵植株各组织cd浓度、富集系数(bcf)、转运系数(tf)的影响
[0061][0062][0063]
注：ck为单独0.3g
·
kg-1
cd.表中数值为平均值
±
se.根据lsd测验，同一列中不同小写字母表示在p≤0.05水平上差异显著.
[0064]
(2)不同处理对向日葵植株生长的影响
[0065]
如表4所示，cd胁迫下，向日葵株高、根长、干重、鲜重与对照相比均显著降低，并且随着cd浓度的升高(cd1到cd2)，受影响程度越大；单独使用ala与对照相比显著提高了向日葵的根长和植株的干、鲜重；而cd2胁迫下添加ala与单独cd2胁迫相比，向日葵幼苗生物量和株高、根长均明显升高，但都显著低于对照组。
[0066]
与对照相比，单独添加edds/ca，向日葵株高、根长和干、鲜重均显著降低。cd2胁迫下添加edds/ca与单独cd2胁迫相比，显著降低了向日葵的株高、根长和干、鲜重，对向日葵植株生长具有抑制作用，而通过叶面喷施ala可以显著缓解这种抑制作用，与cd+edds相比，外源添加ala显著提高了向日葵株高和根长以及根、茎、叶的鲜重和干重，增加幅度分别达到了27％和25％以及103％、51％、59％和65％、67％、89％。
[0067]
表4不同处理对向日葵植株根、茎、叶鲜重、干重和株高、根长的影响
[0068][0069][0070]
注：cd1为0.15g
·
kg-1
cd，cd2为0.30g
·
kg-1
cd.根据duncan’s测验，表中同一列中不同小写字母表示差异显著(p≤0.05).
[0071]
(3)不同处理对向日葵植株绿素含量的影响
[0072]
由表5可以看出，与对照相比，cd2胁迫下叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素的含量显著降低，且随着cd浓度升高而降低，表明高浓度cd(cd2,0.30g
·
kg-1)胁迫对向日葵叶绿素的影响更大；edds/ca单独使用与对照相比叶绿素b和总叶绿素含量显著下降。与cd2单独处理相比，cd2+ca/edds处理使向日葵内叶绿素和类胡萝卜素含量显著下降，这可能是因为ca/edds增加了土壤中cd的流动性，促进了向日葵对镉的吸收，植物细胞内cd浓度进一步增加，加剧了对细胞内叶绿体结构的影响，进而降低了植物细胞内的叶绿素含量。而叶面喷施ala又显著提高了叶绿素和类胡萝卜素的含量，与cd2+edds/ca相比，cd2+edds/ca+ala处理下叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素含量显著升高，且cd2+edds+ala和cd2+ca+ala处理分别提高了57％，43％，54％、32％和47％，76％，52％和56％，说明ala与edds/ca复配可以提高cd胁迫下向日葵幼苗叶绿素含量。
[0073]
表5不同处理对向日葵植株叶绿素和类胡萝卜素含量(mg
·
g-1
fw)的影响
[0074][0075][0076]
注：cd1为0.15g
·
kg-1cd，cd2为0.30g
·
kg-1cd.根据duncan’s测验，同一列中不同小写字母表示在p≤0.05水平上差异显著.
[0077]
(4)不同处理对向日葵植株ros和mda的影响
[0078]
由表6可以看出，与空白对照相比，cd2胁迫下，向日葵植株的ros和mda含量都显著升高，说明cd胁迫使植物细胞产生了明显的膜脂质过氧化反应。与单独cd2胁迫相比，cd+ca/edds共同处理下，向日葵幼苗ros和mda含量显著升高，其中cd+edds处理与cd2胁迫相比，根和叶中-oh分别提高了53％和30％；与单独cd2胁迫相比，cd+ala处理下ros和mda含量在向日葵根和叶中均显著降低。
[0079]
cd+edds/ca+ala复合处理与cd+edds/ca处理相比，向日葵幼苗ros和mda含量显著降低，但都没有单独cd+ala处理低。说明ala可以降低cd与edds/ca不同胁迫下植株ros水平和mda含量。
[0080]
表6不同处理对向日葵植株h2o2、o
2-、-oh及mda含量的影响
[0081][0082][0083]
(5)不同处理对向日葵植株抗氧化酶活性的影响
[0084]
如图1所示，与对照相比，0.3g
·
kg-1
cd胁迫下向日葵根和叶中抗氧化酶活性显著增强。单独使用ala与对照相比向日葵根和叶中sod、pod、cat和gr活性也显著升高。与单独cd胁迫相比，cd胁迫下喷施ala显著提高了向日葵根和叶中sod、pod、cat、apx和gr活性，且向日葵叶和根中pod活性分别提高了103％和133％。与单独cd胁迫相比较，cd胁迫下添加edds/ca螯合剂，向日葵根和叶中cat和apx活性显著升高，根中sod和pod也显著升高，叶中升高不明显，gr在叶中显著升高，根中升高不显著；与cd+ca/edds处理相比，外源施加ala(cd+ca/edds+ala)向日葵植株sod、pod、cat、apx和gr均显著升高，说明ala的添加提高了植株的抗氧化酶活性，从而清除多余的h2o2、-oh和o
2-等。
[0085]
(6)不同处理对向日葵植株非蛋白巯基含量的影响
[0086]
如图2所示，与空白对照相比，单独0.3g
·
kg-1
cd胁迫下向日葵根和叶中npt、gsh含量和根中其他非蛋白巯基化合物含量均显著上升。与单独cd胁迫相比，cd胁迫下添加edds/ca(cd+edds/ca)向日葵根和叶中npt和gsh含量显著升高。与空白对照相比，外源喷施ala显著提高了向日葵根和叶npt和gsh含量，其他非蛋白巯基化合物含量在根中显著升高，叶内升高不明显；与单独cd胁迫相比，cd胁迫下添加ala向日葵根和叶中npt含量显著升高，叶中gsh含量和根中其他非蛋白巯基化合物含量也显著升高。cd+edds/ca+ala处理与cd+edds/ca相比，显著提高了向日葵根和叶中npt和gsh含量，说明外源施加ala可以显著提高植株
npt和gsh非蛋白巯基含量。
[0087]
(7)不同处理对向日葵植株谷胱甘肽含量的影响
[0088]
如图3所示，与对照相比，单一cd处理下，总谷胱甘肽含量(gssg+gsh)和gsh/gssg比值在向日葵根和叶中都显著升高。cd+edds处理与单独cd胁迫相比显著增加了向日葵根和叶中gsh/gssg比值；与单独cd胁迫相比，cd+ala处理后，向日葵根和叶中gssg+gsh、gsh含量，叶中gsh/gssg均显著增大。与cd+ca处理相比，cd+ca+ala显著增加了向日葵叶中gssg+gsh和gssg含量及根中gsh/gssg比值；与cd+edds处理相比，cd+edds+ala处理下向日葵根和叶中gssg+gsh含量、根中gsh/gssg比值以及叶中gssg含量显著升高。
[0089]
(8)不同处理对向日葵植株根尖细胞超微结构的影响
[0090]
如图4所示，对照组向日葵根尖细胞线粒体结构正常，细胞核完整，细胞壁清晰、光滑(图4a)。ala单独处理组与对照无明显差异(图4b)。cd胁迫下，向日葵根尖细胞结构遭到破坏，细胞核结构变形，核仁消失，嗜锇颗粒明显增多，液泡变大，增多(图4c)，然而外源ala的使用明显改善这一现象，尽管染色质聚集，但核膜、核仁仍清晰可见(图4d)。cd+ca处理下，细胞壁部分降解，核仁消失，染色质聚集成凝胶状，电子密度增加(图4e)，而cd+ca+ala处理下，核质分布均匀，核仁正常，核膜完整(图4f)。cd+edds处理下，没有完整的细胞器，细胞壁部分降解，没有清晰的细胞膜，细胞核核仁消失，上下端核膜开始降解(图4g)，而cd+edds+ala处理下，细胞壁光滑完整，细胞核核膜完整清晰，线粒体未消失(图4h)。
技术特征：
1.一种利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，其特征在于，包括：(1)向日葵种子播种后，幼苗栽至重金属镉污染的土壤上；(2)在向日葵幼苗移栽3～4周后，向重金属镉污染土壤中施加螯合剂，并对向日葵幼苗的叶片喷施5-氨基乙酰丙酸试剂；所述螯合剂为乙二胺-nn
’-
二琥珀酸三钠盐溶液或柠檬酸；(3)对向日葵进行栽培管理，直至向日葵成熟，收获。2.如权利要求1所述的利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，其特征在于，所述重金属镉污染土壤中镉离子浓度为0.15g
·
kg-1
～0.30g
·
kg-1
。3.如权利要求1所述的利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，其特征在于，所述乙二胺-nn
’-
二琥珀酸三钠盐溶液的添加量为4～6mmol
·
kg-1
。4.如权利要求1所述的利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，其特征在于，所述柠檬酸的添加量为9～11mmol
·
kg-1
。5.如权利要求1所述的利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，其特征在于，所述5-氨基乙酰丙酸的添加量为9～11mg
·
l-1
。
技术总结
本发明公开了一种利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，该方法包括：向日葵种子播种后，幼苗栽至重金属镉污染的土壤上；在向日葵幼苗移栽3～4周后，向重金属镉污染土壤中施加螯合剂，并对向日葵幼苗的叶片喷施5
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