专利名称：高新黄黄色杆菌dt8及其在降解环醚类化合物中的应用技术
技术领域：
本发明涉及一种环醚类化合物降解杆菌及其应用，特别涉及一种黄黄色杆菌DT8 及其在微生物降解环醚类化合物中的应用。
背景技术：
环醚类化合物是工业上应用极其广泛的有机溶剂，包括四氢呋喃(THF)、二噁烷、 三噁烷等。环醚类化合物可通过呼吸道、消化道、皮肤侵入机体，低浓度时对皮肤和粘膜有刺激作用；高浓度时有麻醉作用、肝脏毒性和致死作用；长期的毒性试验表明环醚类化合物对动物还有较强的致癌性。近年来，环醚类物质尤其是THF和二噁烷的消费量逐年增加， 环境污染问题日趋严重。目前多个发达国家如美国、日本、加拿大等已在地下水井及大气中检测到THF和1，4_ 二噁烷的污染；李海燕等发现我国某药厂出厂水和某饮用地表水均存在 THF的污染。因此，由环醚类物质造成环境污染的治理刻不容缓。环醚类物质是含氧杂环类物质，通过一般的高级氧化如臭氧法难以将其降解。生物法去除环醚类物质的污染得到了国内外的一致认可。目前筛选到具有降解THF和1，4_二噁烧的菌株有 Rhodococcus ruber 219，放线菌 CB1190、Pseudonocardia sp. ENV478 以及 Cordyceps sinesis等。但是这些菌株的底物广谱性有待进一步扩展，菌体的扩大培养也较困难。因此，筛选出能够降解多种环醚类物质的菌株，并进行大规模培养以应用于环醚类物质污染的治理具有极其重要的工程价值和经济价值。
发明内容
本发明目的是提供一种由环境中筛选得到的黄黄色杆菌DT8及其在微生物降解环醚类化合物中的应用，并提供了菌体扩培方法和菌剂制备方式，可用于环境中含环醚类化合物的废水及废气的治理。本发明采用的技术方案是黄黄色杆菌DT8 (Xanthobacter flavus DT8)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国·武汉·武汉大学，保藏日期2011年4月四日，保藏编号CCTCC NO =M 2011148。本发明所述黄黄色杆菌DT8菌株的筛选1)菌种来源上海某医药厂污水站好氧池的活性污泥。2)菌株筛选取自上海某医药厂污水站好氧池的活性污泥，与无机盐培养基按 1 l(v/v)混合后制成混合培养基置于广口瓶中，总体积为4L，以1，4_ 二噁烷为底物作为唯一碳源和能源，25°C 35°C驯化培养，并间隔2d加一次底物使得加入后底物浓度达到 500mg/L(底物投加前取样检测残余底物浓度)，间隔7d更换混合培养基，7 9月后，驯化的污泥每天可稳定降解200mg/L 二噁烷，此样品转接入摇瓶进一步富集，获得驯化样品；3)将驯化样品按10%的接入量接种至50mL无机盐培养基，以1，4_ 二噁烷为底物，30°C、160r/min摇床上培养24h后检测残余底物浓度，待底物降解率达到80%左右，再
4以10%的接入量转接到含相等浓度的1，4-二噁烷的新鲜无机盐培养基(培养基成分与驯化培养基相同)中，进行多次传代富集后，进行稀释涂布，挑取单菌落，再以1，4_ 二噁烷为底物，进行降解活性测定，分离纯化，获得一株具有1，4- 二噁烷降解活性的菌株DT8，所述 1，4-二噁烷浓度为100mg/L。本发明所述目的菌株DT8的菌种鉴定1)所述的菌株DT8形态特征和生理生化特征为光学显微镜下观察细胞形状为杆状或弧状，大小为0. 2 0. 5μπιΧ1 2. 5 μ m，有鞭毛，无芽孢，革兰氏染色阴性，在固体平板培养基30°C培养4 后，单菌落呈黄色，圆形，不透明，边缘整齐，易挑起；生理生化试验结果为氧化酶和接触酶阳性，硝酸盐还原试验和柠檬酸盐试验阳性；吲哚、甲基红试验阴性，淀粉水解酶阴性，明胶试验阴性。2)所述的菌株DT8的16S rRNA序列分析首先由提取基因组试剂盒提取目的菌株的全基因组，对该菌株的DNA进行 PCR扩增，获得约1500bp的16S rRNA扩增产物，扩增引物为细菌保守序列的通用引物 F8 (5 ‘ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘)和 Rl541(5 ‘ -AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3 ‘)。该序列经测序后，同GenBank中的基因序列进行同源性比对，发现菌株DT8与黄黄色杆菌 (Xanthobacter flavus)的相似度达 99%。经16S rRNA同源性分析并结合生理生化特征，将本发明菌株鉴定为黄黄色杆菌， 命名为黄黄色杆菌 DT8 (Xanthobacter flavus DT8)。本发明所述的黄黄色杆菌DT8在降解环醚类化合物中的应用。所述的环醚类化合物优选为四氢呋喃(THF)或1，4_ 二噁烷。本发明所述的黄黄色杆菌DT8在降解环醚类化合物中的应用为以含黄黄色杆菌 DT8的菌剂为酶源，以环醚类化合物为底物，于无机盐培养基中，在25 35°C，120 160r/ min摇床培养40 80h，使环醚类化合物降解；所述环醚类化合物为THF或1，4-二噁烷；所述底物初始浓度为50 1200mg/L ；所述无机盐培养基终浓度组成为=Na2HPO4 · 12H20 4. 5g/ L、KH2PO4L Og/L、NH4Cl 1. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、CaCl2 · 2H20 0. 023g/L，微量元素母液 lmL/L, pH 7. 0，溶剂为水，所述微量元素母液终浓度组成=FeSO4 · 7H20 1. Og/L、CuSO4 · 5H20
0.02g/L、H3BO3O. 014g/L、MnSO4 ·4Η20 0. 10g/L、ZnSO4 · 7H20 0. lOg/L,Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/ L、CoCl2 · 6H20 0. 02g/L。进一步，所述含黄黄色杆菌DT8菌的细胞的菌剂为黄黄色杆菌DT8含DT8菌的细胞发酵液。进一步，所述含黄黄色杆菌DT8的菌剂为含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂，所述含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂按如下方法制备将黄黄色杆菌DT8含DT8菌的细胞发酵液于草炭载体和无机盐培养基中，搅拌混勻后，于25 35°C下固态发酵M 48h，30 37°C恒稳干燥，干燥后研磨成粉末，获得含DT8菌的细胞固态菌剂；所述草炭载体为草炭与水以质量比1 2的混合物；所述黄黄色杆菌DT8的含DT8菌的细胞发酵液中干菌体浓度为0.77
1.54g/L ；所述含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂中细胞个数为0. lXKT-SXK^CFU/g ；所述草炭载体的用量和无机盐培养基的用量对本发明没有影响，本发明含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂以DT8的细胞个数来计量，通常能够使含DT8菌的细胞发酵液固态发酵即可。上述所述黄黄色杆菌DT8的含DT8菌的细胞发酵液可按如下步骤制备1)斜面培养将黄黄色杆菌DT8接种至R2A固体培养基，30 32 °C斜面培养40 48h，获得斜面菌体，所述R2A固体培养基终浓度组成为酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉 0. 50g/L、MgSO4 · 7Η200· 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸钠 0. 30g/ L、KH2PO4O. 45g/L，ρΗ7· 2，溶剂为水；琼脂15 18g/L ；2)种子培养挑取步骤1)制备的斜面菌体接种至R2A液体培养基，30 37°C培养M 48h，获得种子液，所述R2A液体培养基终浓度组成为酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉0. 50g/L、MgSO4 · 7H20 0. 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸钠 0. 30g/L、KH2PO4O. 45g/L，ρΗ7· 2， 溶剂为水；3)发酵培养将步骤2)制备的种子液以5 10%接种量接种至发酵培养基， 发酵罐内30 37°C，pH值6. 5 7. 3，溶解氧(DO)维持在2. 0 3. 0，培养40 48h，获得含DT8菌的细胞发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为酵母粉0. 5g/L，Na2HPO4 · 12H20 4. 5g/L、KH2PO4L Og/L、NH4Cl 1. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、CaCl2O. 023g/L，微量元素母液 lmL/L，溶剂为水，初始pH值为6. 7 7. 2，微量元素母液终浓度组成为=FeSO4 · 7H20 1. Og/ L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、H3BO3O. 014g/L、MnSO4 · 4H20 0. 10g/L、ZnSO4 · 7H20 0. 10g/L、 Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 02g/L。另外，所述的黄黄色杆菌DT8的含DT8菌的细胞发酵液还可按如下方法制备a) 斜面培养将黄黄色杆菌DT8接种至R2A固体培养基，30 32°C斜面培养40 48h，获得斜面菌体，所述R2A固体培养基终浓度组成为酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉 0. 50g/L、MgSO4 · 7Η200· 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸钠 0. 30g/L、 KH2PO4O. 45g/L，琼脂15 18g/L，ρΗ7· 2，溶剂为水；b)种子培养挑取步骤a)制备的斜面菌体接种至R2A液体培养基，30 37°C培养M 48h，获得种子液；所述R2A液体培养基终浓度组成为酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉0. 50g/L、MgS04 ·7Η20 0. 05g/L、 胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸钠 0. 30g/L、KH2P040. 45g/L，pH7. 2，溶剂为水；c) 发酵培养将步骤b)制备的种子液以5 10%接种量接种至R2A液体培养基或肉汤培养基，发酵罐内加入甘油消泡剂，30 37°C，pH值6. 5 7. 5，溶解氧(DO)维持在2. 0 3. 0， 培养40 48h，获得含DT8菌的细胞发酵液；所述R2A液体培养基终浓度组成同步骤b)，所述肉汤培养基终浓度组成为酵母粉10g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L，溶剂为水，pH7. 2 7. 4，所述甘油消泡剂的用量对本发明没有影响，通常能够达到消泡目的即可。更进一步，本发明所述的黄黄色杆菌DT8在降解环醚类化合物中的应用为以含黄黄色杆菌DT8的菌剂为酶源，所述的含黄黄色杆菌DT8的菌剂为含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂，以环醚类化合物为唯一碳源和能源，在无机盐培养基中，30 37°C，120 160r/ min摇床培养40 48h，使环醚类化合物降解；所述含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂中细胞个数为1 X 1010CFU/g,所述环醚类化合物为THF或1，4- 二噁烷，THF或二噁烷的初始浓度优选为 50 1200mg/L。本发明所述黄黄色杆菌DT8含DT8菌的细胞发酵液可以直接用于环醚类化合物的降解，取黄黄色杆菌DT8含DT8菌的细胞发酵液0. 5mL (干细胞浓度为0. 77 1. 54g/mL)或取固态菌剂0. 5g(细胞个数为101(lCFU/g)接种至含100mg/L 1,4- 二噁烷的无机盐培养基中，检测1，4_ 二噁烷的降解情况；其中，含DT8菌的细胞发酵液在30 40h内可将1，4_ 二噁烷完全降解；固态菌剂在35 50h内可完全降解1，4_ 二噁烷。本发明含黄黄色杆菌DT8的菌剂降解环醚类化合物的适宜pH值和温度分别为6. 5 7. 5和30 37°C;通过研究菌剂对不同浓度底物的降解情况，表明1，4_ 二噁烷的降解速率受底物初始浓度高低的影响较小，在降解初期并无明显延滞期，但是高浓度(1. 2g/ L)底物不能完全降解。底物浓度均为100mg/L时，THF的降解只需^h，而1，4_ 二噁烷则需要48h，可见DT8对不同底物的降解能力不同。本发明所述干菌体浓度测定方法为取一定量发酵液，测定OD6tltl值，再将发酵液离心，沉淀干燥至恒重，测定发酵液中菌体干重，以OD6tltl值为横坐标，菌体干重为纵坐标，绘制浓度图，根据发酵液中0D_值计算干菌体浓度。本发明所述含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂采用细胞个数CFU/g来表示，其表示方法为取0. 5g固态菌剂溶于5mL的生理盐水中，稀释不同浓度后滴到血球计数板于显微镜下进行菌体计数，再通过单位换算得到细胞个数。本发明所述的采用R2A液体培养基或肉汤培养基作为发酵培养基，在发酵期间不需要向发酵罐中加入其余物质，降低染菌概率，且缩短细胞生长的世代时间，从而在相同时间内获得更多的菌体，该培养基获得的菌体不影响其对环醚类化合物的降解活性。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明黄黄色杆菌DT8菌株易于扩大培养，具有高效降解环醚类化合物的性能，适用于含环醚类化合物的废水或废气的生物降解，环境友好，具有极其重要的工程价值和经济价值。
图1含黄黄色杆菌DT8菌剂对环醚类化合物的降解情况图2含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂制备流程3黄黄色杆菌DT8降解环醚类化合物的性能图4pH值对含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂降解环醚类化合物的影响图5温度对含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂降解环醚类化合物的影响图6含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂对不同浓度环醚类化合物降解的性能，A为黄黄色杆菌DT8的固态菌剂对不同浓度1，4_ 二噁烷降解的性能，B为黄黄色杆菌DT8的固态菌剂对不同浓度THF降解的性能。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此所述无机盐培养基终浓度组成为=Na2HPO4· 12H20 4. 5g/L、KH2PO4L Og/L、NH4Cl 1. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、CaCl2 · 2H20 0. 023g/L，微量元素母液 lmL/L，pH 7. 0，溶剂为水，所述微量元素母液组成=FeSO4 · 7H20 1. Og/L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、H3BO3O. 014g/L、 MnSO4 · 4H200. 10g/L、ZnSO4 · 7H20 0. 10g/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 02g/L。所述R2A液体培养基终浓度组成为酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉 0. 50g/L、MgSO4 · 7H20 0. 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸钠 0. 30g/L、 KH2PO4O. 45g/L，pH7. 2，溶剂为水。所述发酵培养基终浓度组成为酵母粉0. 5g/L，Na2HPO4 · 12H204. 5g/L、 KH2PO4L 0g/L、NH4Cl 1. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、CaCl2O. 023g/L,微量元素母液 ImL/L，溶剂为水，初始pH值为6. 7 7. 2，微量元素母液终浓度组成为=FeSO4 · 7H20 1. Og/ L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、H3BO3O. 014g/L、MnSO4 · 4H20 0. 10g/L、ZnSO4 · 7H20 0. 10g/L、 Na2MoO4 · 2H200. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 02g/L。所述肉汤培养基的终浓度组成为酵母粉10g/L、蛋白胨10g/L、NaC15g/L，溶剂为水，pH7. 2 7. 4。所述R2A固体培养基终浓度组成为R2A液体培养基中加入1. 5% 1. 8%的琼脂。实施例1黄黄色杆菌DT8菌种的筛选及鉴定(1)菌株筛选a、初筛取自上海某医药厂污水站好氧池的活性污泥，与无机盐培养基按 1 l(v/v)混合后制成混合培养基置于广口瓶中，以1，4_ 二噁烷为底物作为碳源和能源， 水浴温度30°C下曝气驯化培养，并间隔2d加一次底物，底物投加前取样检测残余底物浓度后再加入适量的底物，使得加入后1，4_ 二噁烷浓度达到500mg/L，间隔7d更换混合培养液， 7 9个月后，驯化的污泥每天可平均降解约200mg/L二噁烷，说明驯化有效果，此样品转接入摇瓶进一步富集；b、复筛及分离纯化将驯化样品按10%的接入量接种至50mL无机盐培养基(与驯化培养基成分相同)中，以100mg/L的1，4_ 二噁烷为唯一碳源和能源，进行目的菌株的筛选，300C、160r/min摇床上培养，隔24h检测底物残余浓度，待底物浓度降解率达80%以上后，再以10%的接种量转接至含100mg/L的1，4-二噁烷的新鲜无机盐培养基中，以此类推，进行多次传代富集，进行稀释涂布，挑取单菌落，再以1，4- 二噁烷为底物，进行降解活性测定，分离纯化，获得一株具有1，4- 二噁烷降解活性的菌株DT8。(2)菌株鉴定a、菌株形态特征及生理生化特征光学显微镜下观察细胞形状为杆状或弧状，大小为0. 2 0. 5 μ mX 1 2. 5 μ m，有
鞭毛，无芽孢，革兰氏染色阴性，在固体平板培养基30°C培养4 后，单菌落呈黄色，圆形， 不透明，边缘整齐，易挑起；部分生理生化试验结果为氧化酶和接触酶阳性，硝酸盐还原试验和柠檬酸盐试验阳性；吲哚、甲基红试验阴性，淀粉水解酶阴性，明胶试验阴性，糖发酵试验阴性。b、16S rDNA 序列测定首先由提取基因组试剂盒(3S DNA Isolution Kit V2. 2申能博彩生物科技有限公司)提取目的菌株的全基因组，对该菌株的DNA进行PCR扩增，获得约1500bp的16S rRNA 扩增产物，扩增引物为细菌保守序列的通用引物F8 (5 ‘ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘) 和R1541 (5 ‘ -AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3 ‘)。该扩增产物经测序后，同GenBank中的基因序列进行同源性比对，发现菌株DT8与黄黄色杆菌(Xanthobacter flavus)的相似度达99%。经16S rDNA同源性分析并结合生理生化特征，将本发明菌株鉴定为黄黄色杆菌 (Xanthobacter flavus),命名为黄黄色杆菌(Xanthobacter flavus) DT8。实施例2黄黄色杆菌DT8含DT8菌的细胞发酵液的制备1)斜面培养将黄黄色杆菌DT8接种至R2A固体培养基，30°C培养48h，获得斜面菌体。
2)种子培养挑取步骤1)制备的斜面菌体接种至R2A液体培养基，30°C培养Mh， 获得种子液；3)发酵培养将步骤幻制备的种子液以接种量10%接种至发酵培养基，发酵罐内 30°C，pH值7. 0，溶解氧(DO)维持在2. 0 3. 0，培养48h，获得含DT8菌的细胞发酵液；所述含DT8菌的细胞发酵液最终测得菌体0D_约达到2. 0，干菌体浓度达到0. 77g/L。实施例3黄黄色杆菌DT8含DT8菌的细胞发酵液的制备1)斜面培养和种子培养方法同实施例2。2)发酵培养将制备的种子液以接种量10%接种至3. 5L的R2A液体培养基，发酵罐内加入0. 5g甘油作为消泡剂，300C，pH值7. 0，溶解氧(DO)维持2. 0 3. 0，培养48h，获得含DT8菌的细胞发酵液；所述含DT8菌的细胞发酵液最终测得菌体0D_达到4. 0，含DT8 菌的细胞发酵液干菌体浓度达到1. 54g/L0实施例4黄黄色杆菌DT8含DT8菌的细胞发酵液的制备1)斜面培养和种子培养方法同实施例2。2)发酵培养将制备的种子液以接种量10%接种至3. 5L的肉汤培养基，发酵罐内加入0. 5g甘油作为消泡剂，300C，pH值7. 0，溶解氧(DO)维持2. 0 3. 0，培养48h，获得含 DT8菌的细胞发酵液；所述含DT8菌的细胞发酵液最终测得菌体0D_达到3. 0，含DT8菌的细胞发酵液干菌体浓度达到1. 2g/L。实施例5黄黄色杆菌DT8含DT8菌的细胞发酵液菌剂的制备及活性检测1)含DT8菌的细胞发酵液菌剂的制备将实施例3制备方法得到的发酵液出罐直接用IOL的塑料包装桶封装作为液态菌剂，该液态菌剂可直接应用于含1，4_ 二噁烷污水的治理。取液态菌剂0. 5mL接种至含100mg/L 1,4- 二噁烷的50mL无机盐培养基中，间隔4h， 取样检测1，4_ 二噁烷的残余浓度。结果如图1液态菌剂在36h内可将1，4_ 二噁烷完全降解。因此，证明液态菌剂具有较高的降解活性。2)含DT8菌的细胞固态菌剂的制备制备过程如图2所示首先将20g草炭中加入两倍质量的水，混合均勻获得草炭载体60g，灭过菌备用；将实施例2制备方法得到的发酵液出罐后，取发酵液(( _约2. 0，干菌体浓度为0. 77g/L) IOmL加入到灭过菌的含60g草炭载体容器中，再加入IOmL无机盐培养基作为营养液，搅拌混勻后室温固体发酵48h，37°C 恒温干燥，干燥后研磨成粉末分装保存，获得含黄黄色杆菌DT8菌的固态菌剂，其细胞个数稳定在1 X 1010CFU/g左右，取固态菌剂0. 5g接种至含100mg/L 1,4- 二噁烷的50mL无机盐培养基中，间隔4h，取样检测1，4_ 二噁烷的残余浓度。如图1所示固态菌剂在40h内可将 1，4_ 二噁烷完全降解。因此，证明固态菌剂也具有较高的降解活性。实施例6黄黄色杆菌DT8降解不同环醚类化合物的特性将实施例5方法制备的液态菌剂(菌体浓度0D_达2.0)离心富集菌体，用 0. 5mol/L的磷酸缓冲液润洗两次制成含DT8菌的细胞菌悬液，分别接种至以1，4_ 二噁烷和THF为唯一碳源和能源的50mL无机盐培养基，使含DT8菌的细胞菌悬液初始菌体浓度 (OD600)为0. 01 (干重4. 4mg/L) ,1,4- 二噁烷和THF底物初始浓度分别为100mg/L,分别放入温度为30°C、转数为160r/min的摇床中培养，不定时取样，观察底物的降解情况，结果见图3。随着时间的延长，底物浓度逐渐降低至完全降解。相同浓度的底物中THF降解只需 ^h，而1，4_ 二噁烷则需要48h，可见X. flavus DT8对不同底物的降解能力不同。
实施例7pH值对黄黄色杆菌DT8降解环醚类化合物的影响分别称取实施案例5方法制备的含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂0. 5g (固态菌剂细胞个数为ι χ 1010CFU/g)，分别溶于不同初始PH的无机盐培养基中作为降解环醚类化合物的酶源。用Imol/LNaOH水溶液或lmol/LHCl水溶液调节无机盐培养基为不同pH值(4. 0、 5. 0、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、9. 0、10. 0)，实验分两个组(1,4- 二噁烷组和 THF 组)，每个 pH 值设3个平行，1个空白对照，分别加入1，4_ 二噁烷和THF作为唯一的碳源和能源，底物初始浓度分别为100mg/L的条件下，不接酶源作为空白对照，分别置于30°C、160r/min恒温摇床里振荡培养，培养3 后取样，分别测得反应液中残余1，4- 二噁烷和THF的浓度，结果见图4。由图4可见，在pH4. 0 10. 0，微生物均能降解THF和1，4_ 二噁烷；随着pH从4. 0 增大到10. 0，底物的降解率均先增大后减小，固态菌剂降解1，4_ 二噁烷和THF的较适宜的 PH值均为7.0左右。说明固态菌剂在中性的较宽pH范围内能较好得降解底物，为其在不同 PH环境的应用提供了保证。实施例8温度对黄黄色杆菌DT8降解环醚类化合物的影响分别称取实施案例5方法制备的含黄黄色杆菌DT8的固态制剂0. 5g(固态菌剂细胞个数为lX101(lCFU/g)，分别溶于无机盐培养基中作为降解环醚类化合物的酶源。将底物分成1，4- 二噁烷和THF两组，每个温度设3个平行，1个空白对照，空白对照不加固态菌剂， 底物初始浓度均为100mg/L无机盐培养基。将各个样品分别置于温度为25°C、30°C、37°C、 40°C摇床中恒温振荡培养(摇床转数均为160r/min)，培养3 后测反应液中残余底物的浓度。由图5可知，在25°C 40°C温度范围内，固态菌剂均能降解1，4-二噁烷和1~冊，且以THF为唯一碳源和能源时其降解速率均大于1，4_ 二噁烷。但是固态菌剂降解1，4_ 二噁烷的适宜温度为37°C，而降解THF的适宜温度为30°C。因此推断最适温度在30 37°C之间。实施例9黄黄色杆菌DT8降解不同浓度环醚类化合物的性能分别称取实施案例5方法制备的含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂0. 5g(固态菌剂细胞个数为lX101(lCFU/g)，以不同初始浓度的环醚类化合物为底物，在较适宜的培养条件 (PH7.0，温度37°C )下，研究以黄黄色杆菌为优势菌株的菌剂对不同底物浓度环醚类物质的降解性能，实验分为两个组(1，4_ 二噁烷组和四氢呋喃组)，每个底物浓度设3个平行， 1个空白对照，空白对照不加固态菌剂。向无机盐培养基中加入不同浓度的底物，PH7.0，温度37°C下反应135h，间隔他或1 测反应液中底物的浓度，其中1，4_ 二噁烷的底物初始浓度分别为50、100、200、300、400、500、650、850和1200mg/L ；THF的底物初始浓度分别为 50、100、200、500、800、1000和1500mg/L。结果如图6所示，由图A可知，固态菌剂降解1， 4-二噁烷的降解速率受底物初始浓度的影响较小，可见二噁烷对固态菌剂的毒性较小，且在高浓度下可将其完全降解矿化。与其略有不同的是固态菌剂对THF的降解速率显著高于 1，4_二噁烷(图B)，但是该菌株不可完全降解高浓度的THF，即降解至一定浓度后不能再将 THF降解。
权利要求
1.黄黄色杆菌DT8(Xanthobacter flavus DT8)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国 武汉 武汉大学，保藏日期2011年4月四日，保藏编号CCTCC NO =M 2011148。
2.如权利要求1所述的黄黄色杆菌DT8，其特征在于所述的黄黄色杆菌DT8为杆状或弧状，大小为0. 2 0. 5 μ mX 1 2. 5 μ m，有鞭毛，无芽孢，革兰氏染色阴性；在固体平板培养基30°C培养4 后，单菌落呈黄色，圆形，不透明，边缘整齐，易挑起；氧化酶和接触酶阳性，硝酸盐还原试验和柠檬酸盐试验阳性；吲哚、甲基红试验阴性，淀粉水解酶阴性，明胶试验阴性。
3.如权利要求1所述的黄黄色杆菌DT8在降解环醚类化合物中的应用。
4.如权利要求3所述的黄黄色杆菌DT8在降解环醚类化合物中的应用，其特征在于所述的环醚类化合物为四氢呋喃或1，4_ 二噁烷。
5.如权利要求3所述的黄黄色杆菌DT8在降解环醚类化合物中的应用，其特征在于所述的应用为以含黄黄色杆菌DT8的菌剂为酶源，以环醚类化合物为底物，于无机盐培养基中，在25 35°C，120 160r/min摇床培养40 80h，使环醚类化合物降解；所述环醚类化合物为四氢呋喃或1，4_ 二噁烷；所述底物初始浓度为50 1500mg/L ；所述无机盐培养基终浓度组成为=Na2HPO4 · 12H20 4. 5g/L、KH2PO4L Og/L、NH4Cl 1. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/ L、CaCl2 · 2H20 0. 023g/L，微量元素母液lmL/L，pH 7. 0，溶剂为水，所述微量元素母液终浓度组成=FeSO4 · 7H20 1. Og/L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、H3BO3O. 014g/L、MnSO4 · 4H20 0. 10g/L、 ZnSO4 · 7H20 0. 10g/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 02g/L。
6.如权利要求5所述的黄黄色杆菌DT8在降解环醚类化合物中的应用，其特征在于所述含黄黄色杆菌DT8的菌剂为黄黄色杆菌DT8含DT8菌的细胞发酵液。
7.如权利要求5所述的黄黄色杆菌DT8在降解环醚类化合物中的应用，其特征在于所述含黄黄色杆菌DT8的菌剂为含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂，所述含黄黄色杆菌DT8菌的固态菌剂按如下方法制备将黄黄色杆菌DT8含DT8菌的细胞发酵液于草炭载体和所述的无机盐培养基中，搅拌混勻后，于25 35°C下固态发酵M 48h，30 37°C恒稳干燥，干燥后研磨成粉末，获得含DT8菌的细胞固态菌剂；所述草炭载体为草炭与水以质量比1 2 的混合物；所述黄黄色杆菌DT8含DT8菌的细胞发酵液中干菌体浓度为0. 77 1. 54g/L, 所述含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂中细胞个数为0. 1 X 101° 5X 101(lCFU/g。
8.如权利要求6或7所述的黄黄色杆菌DT8在降解环醚类化合物中的应用，其特征在于所述的黄黄色杆菌DT8的含DT8菌的细胞发酵液按如下步骤制备1)斜面培养将黄黄色杆菌DT8接种至R2A固体培养基，30 32°C斜面培养40 48h，获得斜面菌体；所述R2A固体培养基终浓度组成为酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉0. 50g/L、 MgSO4 ·7Η20 0. 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸钠 0. 30g/L、KH2PO4O. 45g/ L，琼脂15 18g/L，ρΗ7· 2，溶剂为水；2)种子培养将步骤1)获得的斜面菌体接种至R2A 液体培养基，30 37°C培养M 48h，获得种子液；所述R2A液体培养基终浓度组成为 酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉0. 50g/L、MgSO4 · 7H20 0. 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸钠 0. 30g/L、KH2PO4O. 45g/L，ρΗ7· 2，溶剂为水；3)发酵培养将步骤幻获得的种子液以5 10%接种量接种至发酵培养基，发酵罐内30 37°C，pH 值6. 5 7. 3，DO值维持2. 0 3. 0，培养40 48h，获得含DT8菌的细胞发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为酵母粉 0. 5g/L，Na2HPO4 · 12H20 4. 5g/L、KH2PO4L Og/L、NH4Cl 1. 5g/L、MgS04 ·7Η20 0. 2g/L、CaCl20. 023g/L,微量元素母液lmL/L，溶剂为水，初始pH值为6. 7 7. 2，微量元素母液终浓度组成为=FeSO4 · 7H20 1. Og/L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、H3BO3O. 014g/ L、MnS04 ·4Η20 0. 10g/L、ZnSO4 · 7H20 0. 10g/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 02g/ L0
9.如权利要求6或7所述的黄黄色杆菌DT8在降解环醚类化合物中的应用，其特征在于所述的黄黄色杆菌DT8的含DT8菌的细胞发酵液按如下步骤制备a)斜面培养将黄黄色杆菌DT8接种至R2A固体培养基，30 32°C斜面培养40 48h，获得斜面菌体；所述R2A固体培养基终浓度组成为酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉0. 50g/L、 MgSO4 ·7Η20 0. 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸钠 0. 30g/L、KH2PO4O. 45g/ L，琼脂15 18g/L，pH7.2，溶剂为水；b)种子培养将步骤a)获得的斜面菌体接种至R2A 液体培养基，30 37°C培养M 48h，获得种子液；所述R2A液体培养基终浓度组成为 酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀粉0. 50g/L、MgSO4 · 7H20 0. 05g/L、胰蛋白胨 0. 50g/L、葡萄糖 0. 50g/L、丙酮酸钠 0. 30g/L、KH2PO4O. 45g/L，ρΗ7· 2，溶剂为水；c)发酵培养将步骤b)获得的种子液以5 10%接种量接种至R2A液体培养基或肉汤培养基，发酵罐内加入甘油消泡剂，30 37°C，pH值6. 5 7. 3，DO值维持2. 0 3. 0，培养40 48h， 获得含DT8菌的细胞发酵液；所述R2A液体培养基终浓度组成同步骤b)，所述肉汤培养基的终浓度组成为酵母粉10g/L、蛋白胨10g/L,NaCl 5g/L，溶剂为水，ρΗ7· 2 7. 4。
10.如权利要求1所述的黄黄色杆菌DT8在降解环醚类化合物中的应用，其特征在于所述的应用为以含黄黄色杆菌DT8的菌剂为酶源，所述的含黄黄色杆菌DT8的菌剂为含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂，以环醚类化合物为唯一碳源和能源，在无机盐培养基中，30 370C，120 160r/min摇床培养40 48h，使环醚类化合物降解；所述含黄黄色杆菌DT8的固态菌剂中细胞个数为lX101(lCFU/g，所述环醚类化合物为THF或1，4_ 二噁烷；所述环醚类化合物初始浓度为50 1200mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种黄黄色杆菌DT8(Xanthobacter flavus DT8)及在降解环醚类化合物中的应用，以含黄黄色杆菌DT8的菌剂为酶源，以环醚类化合物为底物，于无机盐培养基中，在30～37℃，120～160r/min摇床培养40～48h，使底物环醚类化合物降解；所述环醚类化合物为四氢呋喃和1，4-二噁烷；本发明黄黄色杆菌DT8菌株易于扩大培养，具有高效降解环醚类化合物的性能，适用于含环醚类化合物的废水或废气的生物降解，环境友好，具有极其重要的工程价值和经济价值。
文档编号C02F3/34GK102433272SQ20111035528
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者金小君, 陈东之, 陈建孟 申请人:浙江工业大学
