[0001]
本发明属于污染土壤修复领域，具体涉及一种苜蓿-芽孢杆菌联合修复重金属污染土壤的方法
背景技术：
[0002]
土壤重金属污染已经成为严重制约农业发展、危害农产品安全的环境问题。传统的土壤重金属污染修复技术主要包括客土法、钝化法、电动法、淋洗法、植物和微生物修复法。
[0003]
植物修复技术成本低廉、生态效益良好，但是修复植物生长缓慢、生物量低、耐受量差、重金属积累量小等问题限制其大规模应用和推广。苜蓿是营养丰富、具有固氮功能和景观价值的多年生豆科植物，也可作为修复植物吸收和净化土壤重金属等污染物(shu yang,yanqun zu,bo li,yufen bi,le jia,yongmei he,yuan li.2019.response and intraspecific differences in nitrogen metabolism of alfalfa(medicago sativa l.)under cadmium stress.chemosphere 220,69-76)，但单纯的苜蓿富集对重金属污染土壤的修复效率不高。
[0004]
芽孢杆菌是较常见的植物内生细菌，具有防治病虫害、提高植物品质的作用，但是目前苜蓿联合芽孢杆菌对镉污染土壤的修复效果及机制尚不清楚。。
[0005]
根际土壤代谢物包括植物根系分泌物和微生物代谢物，主要由糖类、脂肪酸、氨基酸、脂类等小分子有机物组成。植物不同生长时期与生理状况、土壤中污染物种类与浓度等均会影响根际土壤代谢物的主要组成。已有研究表明，根系分泌物能够通过吸附和络合土壤中重金属影响重金属的生物可利用性和水溶性，进而影响植物对重金属的吸收和转运(mi-na shina,jaehong shima,youngnam you,hyun myung,keuk-soo bang,min cho,seralathan kamala-kannan,byung-taek oh.2012.characterization of lead resistant endophytic bacillus sp.mn3-4 and its potential for promoting lead accumulation in metal hyperaccumulator alnus firma.journal of hazardous.materials 199-200,314-320)。土壤微生物群落结构及多样性是影响土壤肥力与质量、重金属分布与毒性的一个重要因素(ju w.,liu l.,fang l.,cui y.,duan c.,2019.impact of co-inoculation with plant-growth-promoting rhizobacteria and rhizobium on the biochemical responses of alfalfa-soil system in copper contaminated soil.ecotoxicology and environmental safety 167,278-226)。
[0006]
中国文献《印度梨形孢联合紫花苜蓿修复土壤镉污染研究》(主朋月、韩冰等，《环境科学与技术》，第42卷第6期2019年6月)该文献中公开了印度梨形孢联合紫花苜蓿修复土壤镉污染，在重金属镉胁迫下，印度梨形孢的定殖能有效的将镉富集在植物根部，降低镉在地上部分的含量，说明印度梨形孢对植物向根部转移重金属的机制有促进作用，有利于增强植物对重金属环境的耐受和稳定能力。但是该方法不利于通过多茬刈割苜蓿地上部分的方式实现土壤中镉的去除。
[0007]
中国文献《不同植物修复重金属复合污染土壤对土壤中微生物数量与酶活性的影响》(陈海燕，樊霆等，《环境保护》，2018年)该文献利用紫花苜蓿作为修复植物在矿区污染土壤进行实验，研究了紫花苜蓿对重金属(cu、zn、pb、cd)复合污染土壤中微生物数量与酶活性的影响，种植紫花苜蓿的土壤中微生物数量增加，土壤微生物多样性指数显著提高；但是本发明发现紫花苜蓿作为修复植物，不是在重金属复合污染土壤中，而是在镉污染的土壤中进行实验，实验结果显示种植紫花苜蓿的土壤中微生物数量降低，土壤微生物多样性降低明显，长期种植虽然能够降低土壤中镉污染，但是由于微生物数量和多样性的降低会严重影响土壤微生态环境。
技术实现要素：
[0008]
针对现有技术的不足，本发明提供了一种苜蓿-芽孢杆菌联合修复重金属污染土壤的方法。
[0009]
本发明的技术方案
[0010]
一种苜蓿-芽孢杆菌联合修复重金属污染土壤的方法，包括如下步骤：
[0011]
将苜蓿种植在有重金属污染的土壤中，施用芽孢杆菌菌剂，然后进行常规栽培管理至苜蓿收获。
[0012]
根据本发明优选的，所述方法，包括如下：
[0013]
将重金属污染土壤翻整后播种苜蓿种子，苜蓿种子发芽后在其根际土壤中接种芽孢杆菌菌剂，苜蓿生长90～120天后，收获植物地上部分，集中处置，地下部分留在土壤中，再进行新一轮的苜蓿播种和芽孢杆菌接种，直至污染土壤中重金属含量符合土壤环境质量标准。
[0014]
根据本发明优选的，所述芽孢杆菌菌剂的浓度为(3～9)
×
109cfu/ml。
[0015]
根据本发明优选的，所述芽孢杆菌菌剂利用农业废弃物基质发酵制得，所述农业废弃物为农作物秸秆，包括玉米、小麦、水稻、高粱、甘蔗、薯类、棉花之一或二者以上；所述农业废弃物是处理后作为基质，具体为：将农作物秸秆粉碎长度为1-3cm，保持含水率55-70％，有氧发酵20-40天，灭菌后作为发酵基质。
[0016]
根据本发明优选的，所述方法，包括如下步骤：
[0017]
苜蓿种子在重金属污染的土壤中播种密度为每平方米200～500株，播种后定期浇水以保持土壤含水量在最大田间持水量的55％～75％，芽孢杆菌菌剂稀释至活菌浓度为(1～5)
×
108cfu/ml，接种比例为每次每平方米350～650ml，自苜蓿种子发芽后3～4周时间内，每周接种1～2次，苜蓿收获前不再施用菌剂，然后进行常规栽培管理至苜蓿收获。
[0018]
根据本发明优选的，所述重金属污为镉污染。
[0019]
根据本发明优选的，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。
[0020]
进一步优选的，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ttl1。
[0021]
本发明的有益效果
[0022]
1、本发明涉及的技术方案有效改良了在镉污染土壤中只种植苜蓿造成土壤中微生物数量和微生物多样性的降低，本发明通过苜蓿-芽孢杆菌联合修复重金属污染土壤，避免了由于苜蓿在镉污染土壤中长期种植造成的土壤微生态环境破坏。
[0023]
2、本发明涉及的技术方案，可以有效地将苜蓿地下部分的重金属转移至对地上部
分，通过多茬刈割苜蓿地上部分的方式实现土壤中镉的去除，并且节省了种植成本。
[0024]
3、本发明涉及的技术方案，接种芽孢杆菌保护并促进了污染地中苜蓿的生长，加强了植物对重金属的积累，提高了土壤中重金属的去除效果。
[0025]
4、本发明采用农业废弃物作为芽孢杆菌的生长基质，既节省了微生物生长所需化学培养基的成本，又可提高土壤肥力，改善土壤结构，并实现农业废弃物资源化利用。
[0026]
5、治理效果好，运行成本低廉，操作方式简便，具有很好的理论和应用价值。
附图说明
[0027]
图1为实施例1中接种ttl1芽孢杆菌实验组与苜蓿对照组生长的苜蓿植株照片。
具体实施方式
[0028]
下面结合实例对本发明进一步详细说明，但保护范围不限于此。
[0029]
实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。
[0030]
实施例1
[0031]
一种苜蓿-芽孢杆菌联合修复重金属污染土壤的方法。
[0032]
负载镉土壤的制备：取山东省科学院东区设施菜地表层土壤，自然风干，过2mm筛，按水土比1ml:1.2g加入氯化镉溶液，平衡60天，最终土壤中总镉浓度为3.8mg/kg。
[0033]
农业废弃物基质的制备：玉米秸秆粉碎为1-3cm，浇水使基质含水率按质量分数计保持在70％，有氧发酵40天。
[0034]
枯草芽孢杆菌ttl1，来自山东省科学院生态研究所微生物保藏库，可由此购买获得，保藏号为z206d4。
[0035]
枯草芽孢杆菌bsg2，来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，可由此购买获得，保藏号为accc 19742。
[0036]
枯草芽孢杆菌bgl3，来自山东省科学院生态研究所微生物保藏库，可由此购买获得，保藏号为z208a4。
[0037]
枯草芽孢杆菌ttl1菌体悬浮液的制备：luria-bertani液体培养基在121℃下灭菌30min，接入体积比例1％的芽孢杆菌液体菌种，在35℃，150rpm下活化培养2天，然后将此菌液按固液比例1g:10ml(即固体基质：菌液)接入高压蒸汽灭菌后的农业废弃物基质中，在35℃，150rpm下扩大培养7天。
[0038]
所述芽孢杆菌菌体最终发酵液为半固体状态，其中枯草芽孢杆菌ttl1的活菌浓度为4
×
109cfu/ml。
[0039]
枯草芽孢杆菌bsg2菌体发酵液的制备方法同上，最终获得发酵液为半固体状态，其中枯草芽孢杆菌bsg2的活菌浓度为4.5
×
109cfu/ml。
[0040]
枯草芽孢杆菌bgl3菌体发酵液的制备方法同上，最终获得发酵液为半固体状态，其中枯草芽孢杆菌bgl3的活菌浓度为5.6
×
109cfu/ml。
[0041]
称取1.5kg负载镉土壤于塑料盆(直径16.5cm
×
高度17.5cm)中，施磷酸二氢钾0.33g、尿素0.35g，每盆均匀撒播12粒经5％过氧化氢溶液消毒处理后的苜蓿种子，表面覆盖薄土层，定期浇水以保持土壤含水量在最大田间持水量的60％，苜蓿种子发芽后4周时间内，在实验组根际土壤中每周周一添加1次15ml稀释10倍的菌体发酵液，苜蓿对照组根际土
壤中每周周一添加1次15ml经高压灭菌后的稀释10倍的菌体发酵液，每个组设置三次重复，苜蓿生长90天后，收获植物，分为地上和地下部分，分别测定干重及重金属含量。
[0042]
重金属转移系数＝植物地上部分重金属含量/植物地下部分重金属含量
[0043]
重金属富集系数＝植物地上部分重金属含量/处理后土壤中重金属含量
[0044]
总镉去除率＝(植物地上部分重金属含量
×
地上部分生物量+地下部分重金属含量
×
地下部分生物量)/(处理前土壤中重金属含量
×
土壤质量)*100％
[0045]
苜蓿对照组中，添加灭菌后ttl1的处理中，紫花苜蓿地上部分的干重和镉含量分别比地下部分的高28％和28％，重金属镉富集系数为3.7；添加灭菌后bsg2的处理中，紫花苜蓿地上部分的干重和镉含量分别比地下部分的高31％和35％，重金属镉富集系数为3.5；添加灭菌后bgl3的处理中，紫花苜蓿地上部分的干重和镉含量分别比地下部分的高7％和13％，重金属镉富集系数为2.7(表1)，说明紫花苜蓿能够从土壤中的富集镉，而且主要富集在地上部分，可通过多茬刈割地上部分的方式实现土壤中镉的去除。
[0046]
相比苜蓿对照组，接种ttl1芽孢杆菌发酵液后，苜蓿植株更高、长势更好(见图1)，地上和地下部分干重分别增加36％和21％，镉转移系数、镉富集系数和土壤中总镉去除率分别增加15％、53％和139％；接种bsg2后的紫花苜蓿地上和地下部分干重分别增加38％和31％，镉转移系数、镉富集系数和土壤中总镉去除率分别增加14％、86％和124％；接种bgl3后的紫花苜蓿地上干重增加3％，地下部分干重无显著变化，镉富集系数和土壤中总镉去除率分别增加7％和10％，镉转移系数无显著变化(表1)，说明接种芽孢杆菌显著促进了紫花苜蓿的生长，并且显著提高了重金属污染土壤的修复效率，其有益效果具有一定的菌种特异性，ttl1芽孢杆菌的促进作用更大。
[0047]
表1接种芽孢杆菌对苜蓿生物量和总镉去除率的影响
[0048][0049]
实施例2
[0050]
一种苜蓿-芽孢杆菌联合修复重金属污染土壤的方法。
[0051]
负载镉土壤的制备：取山东省科学院东区设施菜地表层土壤，自然风干，过2mm筛，按水土比1ml:1.5g加入氯化镉溶液，平衡60天，最终土壤中总镉浓度为5.5mg/kg。
[0052]
农业废弃物基质的制备：小麦秸秆粉碎为1-3cm，浇水使质量含水率保持在65％，有氧发酵35天。
[0053]
枯草芽孢杆菌bsg2菌体悬浮液的制备：luria-bertani液体培养基在121℃下灭菌30min，接入体积比例1％的芽孢杆菌液体菌种，在35℃，150rpm下活化培养2天，然后将此菌液按固液比例1g:10ml(即固体基质：菌液)接入高压蒸汽灭菌后的农业废弃物基质中，在35℃，150rpm下扩大培养7天。
[0054]
所述芽孢杆菌菌体最终发酵液为半固体状态，其中枯草芽孢杆菌bsg2的活菌浓度为5
×
109cfu/ml。
[0055]
枯草芽孢杆菌ttl1菌体发酵液的制备方法同上，最终获得发酵液为半固体状态，其中枯草芽孢杆菌ttl1的活菌浓度为4.1
×
109cfu/ml。
[0056]
枯草芽孢杆菌bgl3菌体发酵液的制备方法同上，最终获得发酵液为半固体状态，其中枯草芽孢杆菌bgl3的活菌浓度为5.7
×
109cfu/ml。
[0057]
称取1.5kg负载镉土壤于塑料盆(直径16.5cm
×
高度17.5cm)中，施磷酸二氢钾0.33g、尿素0.35g，每盆均匀撒播12粒经5％过氧化氢溶液消毒处理后的苜蓿种子，表面覆盖薄土层，定期浇水以保持土壤含水量在最大田间持水量的60％，苜蓿种子发芽后4周时间内，在实验组根际土壤中每周周一和周四分别添加1次15ml稀释10倍的菌体发酵液，苜蓿对照组根际土壤中每周周一和周四添加1次15ml经高压灭菌后的稀释10倍的菌体发酵液，每个组重复三次，苜蓿生长100天后，收获整株植物。此外，设置空白对照组、芽孢杆菌对照组和苜蓿对照组，每个组重复三次。
[0058]
采用illumina hiseq高通量测序技术对土壤中细菌的16s rdna的v3-v4区pcr扩增产物进行测序，并对测序数据进行微生物alpha多样性分析，统计各土壤样品在97％相似度水平下的ace及shannon指数，其中ace指数用于衡量物种丰度即物种数量的多少，shannon指数用于衡量物种多样性。
[0059]
相比空白对照，ttl1芽孢杆菌对照组的土壤微生物丰富度指数增加10％、多样性指数增加10％；bsg2芽孢杆菌对照组的土壤微生物丰富度指数增加7％、多样性指数增加6％；bgl3芽孢杆菌对照组的土壤微生物丰富度指数增加1％、多样性指数增加2％(表2)，说明接种芽孢杆菌能够提高土壤微生物结构和功能多样性，进而提高土壤肥力和质量，其有益效果有一定的菌种特异性，ttl1芽孢杆菌的促进作用更大。
[0060]
相比空白对照，添加灭菌后ttl1的苜蓿对照组的土壤微生物丰富度指数降低12％，多样性指数降低23％；添加灭菌后bsg2的苜蓿对照组的土壤微生物丰富度指数降低12％，多样性指数降低19％；添加灭菌后bgl3的苜蓿对照组的土壤微生物丰富度指数降低14％，多样性指数降低21％(表2)，说明只种植苜蓿降低了土壤微生物结构和功能多样性，不利于保护土壤肥力和质量。
[0061]
相比苜蓿对照，播种苜蓿后接种ttl1芽孢杆菌发酵液使得土壤微生物丰富度指数增加19％、多样性指数增加57％、总镉去除率增加153％；播种苜蓿后接种bsg2芽孢杆菌发酵液使得土壤微生物丰富度指数增加12％、多样性指数增加24％、总镉去除率增加110％；播种苜蓿后接种bgl3芽孢杆菌发酵液使得土壤多样性指数增加5％、总镉去除率增加9％，微生物丰富度指数无显著变化(表2)，说明接种芽孢杆菌不仅显著增加了紫花苜蓿对重金属的去除效率，降低重金属对植物的毒性，而且能够提高土壤微生物结构和功能多样性，避
免了只种植苜蓿对土壤肥力和质量造成的不利影响，进而加强苜蓿修复重金属污染土壤的整体效果，其有益效果有一定的菌种特异性，ttl1芽孢杆菌的促进效果更显著。
[0062]
表2接种芽孢杆菌对土壤生物性质及苜蓿积累镉的影响
[0063][0064]
实施例3
[0065]
一种苜蓿-芽孢杆菌联合修复改良重金属污染土壤的方法。
[0066]
负载镉土壤的制备：取山东省科学院东区设施菜地表层土壤，自然风干，过2mm筛，按水土比1ml:2g加入硝酸镉溶液，平衡60天，最终土壤中总镉浓度为4.0mg/kg。
[0067]
枯草芽孢杆菌bgl3菌体悬浮液的制备：luria-bertani液体培养基在121℃下灭菌30min，接入体积比例1％的芽孢杆菌液体菌种，在35℃，150rpm下活化培养2天，然后将此菌液按体积比1％再接入高压蒸汽灭菌后的luria-bertani液体培养基中，在35℃，150rpm下扩大培养7天。
[0068]
所述芽孢杆菌菌体最终发酵液为液体状态，其中枯草芽孢杆菌bgl3的活菌浓度为6
×
109cfu/ml。
[0069]
枯草芽孢杆菌ttl1菌体发酵液的制备方法同上，最终获得发酵液为半固体状态，其中枯草芽孢杆菌ttl1的活菌浓度为6.5
×
109cfu/ml。
[0070]
称取1.5kg负载镉土壤置于塑料盆(直径16.5cm
×
高度17.5cm)中，施磷酸二氢钾0.33g、尿素0.35g，每盆均匀撒播12粒经5％过氧化氢溶液消毒处理后的苜蓿种子，表面覆盖薄土层，定期浇水以保持土壤含水量在最大田间持水量的60％，苜蓿种子发芽后4周时间内，在实验组根际土壤中每周一、周三和周五分别添加1次15ml稀释10倍的菌体发酵液，苜蓿对照组根际土壤中每周一、周三和周五分别添加1次15ml经高压灭菌后的稀释10倍的菌体发酵液，每个组重复三次，苜蓿生长110天后，收获整株植物，采用抖根法抖掉根部多余土壤，收集用于测定土壤总镉及有效态镉含量，粘在根部的剩余土壤采集为根际土壤，用于提取并测定代谢物。此外，设置空白对照组、芽孢杆菌对照组和苜蓿对照组，每个组重复三次。
[0071]
土壤重金属的有效性用于衡量土壤重金属被植物吸收难易程度，一般采用可被某
study on root exudates of cadmium hyperaccumulator sedum alfredii.chinese journal of analytical chemistry,43(1):7-12)，与实际农田情况相差较远，本发明采用盆栽试验，采集根际土壤代谢物(包括根系分泌物和微生物代谢物)，筛选出不同于以往报道的有显著差异的5种有机酸和4种氨基酸化合物，分析相应的代谢途径可理论指导植物-微生物联合修复重金属污染土壤的机制揭示和策略制定。
[0080]
表4芽孢杆菌对苜蓿根际土壤中有机酸和氨基酸代谢物的影响
[0081][0082]
综上，本发明通过苜蓿-芽孢杆菌联合修复重金属污染土壤，避免了由于苜蓿在镉污染土壤中长期种植造成的土壤微生态环境破坏；可以有效地将苜蓿地下部分的重金属转移至对地上部分，通过多茬刈割苜蓿地上部分的方式实现土壤中镉的去除，节省了种植成本；接种芽孢杆菌保护并促进了污染地中苜蓿的生长，加强了植物对重金属的积累，提高了土壤中重金属的去除效果；本发明发现芽孢杆菌主要通过调控脂肪酸代谢和氨基酸代谢途径促进镉的活化与迁移、提高镉的生物可利用性、并加强苜蓿对镉的吸收与转运；筛选出不同于以往报道的有显著差异的5种有机酸和4种氨基酸化合物，分析相应的代谢途径可理论指导植物-微生物联合修复重金属污染土壤的机制揭示和策略制定。尤其是苜蓿-枯草芽孢杆菌ttl1联合修复重金属污染土壤作用效果显著，具有一定的菌种特异性。
技术特征：
1.一种苜蓿-芽孢杆菌联合修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，包括如下步骤：将苜蓿种植在有重金属污染的土壤中，施用芽孢杆菌菌剂，然后进行常规栽培管理至苜蓿收获。2.如权利要求1所述方法，其特征在于，包括如下步骤：将重金属污染土壤翻整后播种苜蓿种子，苜蓿种子发芽后在其根际土壤中接种芽孢杆菌菌剂，苜蓿生长90～120天后，收获植物地上部分，集中处置，地下部分留在土壤中，再进行新一轮的苜蓿播种和芽孢杆菌接种，直至污染土壤中重金属含量符合土壤环境质量标准。3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述芽孢杆菌菌剂的浓度为(3～9)
×
109cfu/ml。4.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述芽孢杆菌菌剂利用农业废弃物基质发酵制得，所述农业废弃物为农作物秸秆，包括玉米、小麦、水稻、高粱、甘蔗、薯类、棉花之一或二者以上；所述农业废弃物是处理后作为基质，具体为：将农作物秸秆粉碎长度为1-3cm，保持含水率55-70％，有氧发酵20-40天，灭菌后作为发酵基质。5.如权利要求2所述方法，其特征在于，包括如下步骤：苜蓿种子在重金属污染的土壤中播种密度为每平方米200～500株，播种后定期浇水以保持土壤含水量在最大田间持水量的55％～75％，芽孢杆菌菌剂稀释至活菌浓度为(1～5)
×
108cfu/ml，接种比例为每次每平方米350～650ml，自苜蓿种子发芽后3～4周时间内，每周接种1～2次，苜蓿收获前不再施用菌剂，然后进行常规栽培管理至苜蓿收获。6.如权利要求1-5任一项所述方法，其特征在于，所述重金属污为镉污染。7.如权利要求1-5任一项所述方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。8.如权利要求1-5任一项所述方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ttl1。
技术总结
本发明涉及一种苜蓿
技术开发人、权利持有人：李琪 邢颖娜 张强 王加宁 陈贯虹 傅晓文 季蕾 李天元
